USP <86>dan Masa Depan Pengujian Endotoksin: Hal yang Perlu Diketahui Laboratorium QC

Pengujian endotoksin memasuki era baru.

Selama bertahun-tahun, pengujian endotoksin bakteri identik dengan metode yang menggunakan reagen berbasis lisat, seperti metode gel-clot, turbidimetric, dan chromogenic. Namun, perkembangan teknologi mulai mengubah pendekatan tersebut. Hadirnya USP <86> (Bacterial Endotoxins Test Using Recombinant Reagents) menambahkan pilihan metode pengujian endotoksin menggunakan reagen yang tidak berasal dari hewan. Bab ini mencakup metode recombinant Factor C (rFC) dan recombinant cascade reagent (rCR), sebagai tambahan terhadap metode yang dijelaskan dalam USP <85>.

Selain itu, revisi panduan FDA pada Maret 2026 mengenai pengujian pirogen dan endotoksin menunjukkan pendekatan regulasi yang semakin terbuka terhadap penggunaan reagen rekombinan. Meski demikian, metode yang dipilih tetap harus sesuai dengan tujuan pengujiannya.

Bagi laboratorium QC, perubahan ini bukan sekadar mengganti satu jenis reagen dengan reagen lainnya. Hal yang lebih penting adalah bagaimana memilih, memverifikasi, menerapkan, dan mengendalikan metode pengujian agar hasilnya tetap dapat diandalkan. Beberapa faktor yang perlu diperhatikan meliputi kesesuaian metode, interferensi sampel, sensitivitas, kontrol pengujian, peralatan, kompetensi analis, interpretasi data, dan karakteristik produk yang diuji.

1. Apa itu USP <86> ?

USP <86> adalah bab farmakope yang membahas pengujian endotoksin bakteri menggunakan reagen rekombinan. Bab ini menyediakan pilihan metode tambahan yang menggunakan reagen non-hewani, termasuk:

• Recombinant Factor C (rFC): menggunakan protein Factor C hasil rekayasa rekombinan untuk mendeteksi endotoksin.
• Recombinant Cascade Reagent (rCR): menggunakan komponen protein rekombinan yang bekerja melalui rangkaian reaksi untuk mendeteksi endotoksin.

Kedua pendekatan tersebut dirancang untuk mendeteksi atau mengukur kadar endotoksin dari bakteri Gram-negatif dengan memanfaatkan protein rekombinan yang berkaitan dengan mekanisme pengenalan endotoksin pada kepiting tapal kuda (horseshoe crab).

Metode tradisional berbasis lisat dan metode rekombinan memiliki kaitan dari sisi mekanisme biologis, tetapi menggunakan sistem reagen yang berbeda. Oleh karena itu, saat mengevaluasi metode baru, pertanyaan yang perlu diajukan bukan hanya apakah reagen tersebut rekombinan atau bukan, melainkan: Apakah metode tersebut sesuai secara ilmiah untuk produk, matriks sampel, batas endotoksin, dan tujuan pengujian yang diinginkan?

2. USP <85> dan USP <86> bukan sekadar Metode Lama dan Metode Baru

Perkembangan pengujian endotoksin tidak berarti metode LAL/TAL tradisional harus langsung digantikan oleh metode rekombinan. USP <85> tetap menjadi kerangka pengujian endotoksin bakteri yang mencakup metode gel-clot dan metode fotometrik, termasuk pendekatan turbidimetric dan chromogenic. Sementara itu, USP <86> menambahkan pilihan metode menggunakan reagen rekombinan.

Laboratorium dapat memilih metode yang paling sesuai dengan kebutuhannya, dengan mempertimbangkan:

• Jenis dan karakteristik produk
• Kompleksitas matriks sampel
• Batas endotoksin yang berlaku
• Sensitivitas yang dibutuhkan
• Apakah pengujian bertujuan menentukan batas atau mengukur kadar secara kuantitatif
• Peralatan yang sudah tersedia
• Riwayat metode yang digunakan
• Kebutuhan validasi atau verifikasi
• Persyaratan regulasi
• Jumlah sampel yang diuji
• Ketersediaan dan keberlanjutan pasokan reagen

Jadi, metode tidak sebaiknya dipilih hanya karena teknologinya lebih baru. Sebaliknya, metode tradisional juga tidak otomatis lebih baik hanya karena sudah lama digunakan. Pemilihan metode harus didasarkan pada kebutuhan pengujian dan kesesuaian ilmiahnya.

3. Mengapa metode pengujian endotoksin rekombinan semakin diminati?

Menggunakan reagen yang tidak berasal dari hewan

Metode LAL/TAL tradisional menggunakan bahan biologis yang diperoleh dari kepiting tapal kuda. Sebaliknya, metode rekombinan menggunakan protein yang dihasilkan melalui teknologi rekombinan. Hal ini memberikan alternatif bagi laboratorium yang ingin mengurangi ketergantungan pada bahan yang berasal dari hewan.

Memberikan lebih banyak pilihan metode

Sebelumnya, laboratorium umumnya memilih berbagai variasi metode LAL atau TAL. Dengan berkembangnya teknologi rekombinan, pilihan metode pengujian endotoksin menjadi lebih beragam. Hal ini dapat membantu perusahaan yang memiliki banyak laboratorium atau ingin menyelaraskan prosedur QC di berbagai lokasi.

Pertanyaan yang perlu dipertimbangkan bukan lagi sekadar:

“Reagen endotoksin apa yang sebaiknya dibeli?”

Melainkan:

“Sistem pengujian endotoksin mana yang paling sesuai dengan jenis produk dan strategi QC laboratorium untuk jangka panjang?”

4. Pertanyaan terpenting: Apakah metode cocok dengan matriks sampel?

Reagen yang canggih tidak otomatis menghilangkan interferensi dari sampel. Dalam pengujian endotoksin, komponen dalam formulasi farmasi dapat memengaruhi hasil pengujian, misalnya dengan:

• Menghambat reaksi pengujian
• Meningkatkan respons reaksi
• Mengikat endotoksin
• Menutupi atau mengurangi kemampuan endotoksin untuk terdeteksi (masking)
• Mengubah agregasi endotoksin
• Memengaruhi pembacaan optik
• Berinteraksi dengan komponen reagen

Karena itu, mengganti jenis reagen tidak menghilangkan kebutuhan untuk mengevaluasi kesesuaian metode. Hal ini menjadi semakin penting ketika laboratorium menggunakan metode dengan prinsip analisis yang berbeda.

5. Kesesuaian metode menentukan apakah pengujian dapat diandalkan

Suatu metode mungkin terbukti bekerja dengan baik secara umum, tetapi belum tentu sesuai untuk semua jenis sampel. Sebagai contoh, laboratorium berhasil mendeteksi endotoksin standar dalam air menggunakan metode tertentu. Hasil tersebut tidak otomatis membuktikan bahwa metode yang sama akan bekerja dengan baik pada:

• Formulasi antibodi monoklonal
• Obat berbasis peptida
• Formulasi mRNA-LNP
• Sampel dengan kandungan protein tinggi
• Formulasi yang mengandung surfaktan
• Bahan aktif farmasi (Active Pharmaceutical Ingredient atau API) berkonsentrasi tinggi
• Sampel proses dengan komposisi kompleks

Komposisi sampel dapat memengaruhi respons pengujian. Oleh sebab itu, kesesuaian metode perlu dibuktikan menggunakan produk yang sebenarnya atau matriks representatif yang dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah.

Untuk metode rekombinan, FDA juga menekankan perlunya memastikan bahwa metode sesuai dengan tujuan penggunaannya. Kompleksitas bahan yang diuji perlu dipertimbangkan dalam proses verifikasi tersebut.

6. Positive Product Control (PPC) tetap penting

Positive Product Control (PPC) merupakan salah satu komponen penting dalam mengevaluasi kesesuaian metode pengujian endotoksin. Tujuannya adalah mengetahui apakah matriks sampel memengaruhi pemulihan endotoksin (endotoxin recovery) dalam kondisi pengujian yang digunakan.

Hasil sampel yang negatif tidak selalu membuktikan bahwa sampel bebas dari endotoksin yang dapat dideteksi. Jika matriks menghambat respons pengujian, endotoksin mungkin tidak terdeteksi meskipun sebenarnya ada. Karena itu, evaluasi hasil sebaiknya tidak hanya mengandalkan hasil sampel, tetapi juga mempertimbangkan:

• Hasil sampel
• Kontrol negatif
• Kinerja kurva standar dan kontrol pengujian
• Hasil pemulihan PPC

Seluruh komponen tersebut perlu dievaluasi bersama untuk membantu memastikan hasil pengujian dapat dipercaya.

7. Reagen rekombinan bukan berarti bebas interferensi

Salah satu kesalahpahaman yang perlu dihindari adalah menganggap metode rekombinan tidak akan mengalami interferensi.Memang, reagen rekombinan dapat mengurangi ketergantungan pada lisat yang berasal dari hewan. Namun, hal tersebut tidak berarti semua matriks sampel farmasi otomatis cocok dengan metode ini.

Interferensi masih dapat terjadi. Misalnya, protein, lipid, surfaktan, atau bahan tambahan lainnya dalam formulasi dapat berinteraksi dengan endotoksin maupun sistem analisis. Oleh karena itu, laboratorium tetap perlu mengevaluasi:

• Pengenceran sampel
• Maximum Valid Dilution (MVD), yaitu pengenceran maksimum yang diperbolehkan untuk metode tersebut
• Pemulihan PPC
• Pemulihan endotoksin
• Persiapan sampel
• Kemungkinan adsorpsi
• Interferensi kimia
• Interferensi optik
• Rentang deteksi metode

Pertanyaan utamanya tetap sama:

Apakah metode yang digunakan mampu mendeteksi endotoksin yang benar-benar ada dalam produk secara andal?

8. Mengapa pengenceran sampel tetap penting?

Pengenceran merupakan salah satu cara praktis untuk mengurangi interferensi matriks.Jika sampel pada konsentrasi tinggi mengganggu reaksi pengujian endotoksin, pengenceran dapat membantu mengurangi konsentrasi komponen yang menyebabkan interferensi. Namun, pengenceran tidak boleh dilakukan tanpa batas. Pengenceran yang dipilih harus memiliki dasar ilmiah dan tidak boleh melampaui MVD yang berlaku. Ada dua risiko yang perlu diperhatikan:

• Pengenceran terlalu sedikit: interferensi masih dapat terjadi
• Pengenceran terlalu banyak: kadar endotoksin bisa turun di bawah rentang deteksi yang berguna bagi metode tersebut

Karena itu, kondisi pengujian perlu ditetapkan dengan mempertimbangkan batas endotoksin, sensitivitas metode, konsentrasi sampel, interferensi matriks, dan MVD. Untuk pengujian endotoksin kuantitatif, hubungan antara faktor-faktor tersebut perlu ditentukan sebelum pengujian rutin dilakukan.

9. Bagaimana dengan metode Kinetic Chromogenic?

Metode kinetic chromogenic tetap menjadi salah satu pilihan penting untuk pengujian endotoksin secara kuantitatif. Berbeda dengan metode gel-clot yang mengamati terbentuknya gel, metode kinetic chromogenic memantau perkembangan respons warna dari waktu ke waktu. Respons tersebut kemudian dihubungkan dengan konsentrasi endotoksin menggunakan kurva standar yang telah dikalibrasi. Hasil kuantitatif ini dapat digunakan untuk:

• Pemantauan proses produksi
• Pengujian bahan baku
• Pengujian produk antara
• Pengujian produk jadi
• Analisis tren hasil pengujian
• Pengembangan metode
• Kegiatan penelitian

Namun, hasil kuantitatif tidak otomatis berarti hasilnya dapat dipercaya.Laboratorium tetap perlu memastikan bahwa:

• Kurva standar memenuhi kriteria yang ditetapkan
• Pengenceran sampel sesuai
• Pemulihan PPC dapat diterima
• Kontrol pengujian memenuhi persyaratan
• Sensitivitas metode memadai
• Hasil memiliki keterulangan yang sesuai
• Metode cocok dengan matriks sampel

Kit Kinetic Chromogenic Endotoxin Test dari FireGene ditujukan untuk pengujian endotoksin kuantitatif dan dapat digunakan dalam alur kerja yang sesuai dengan metode kinetic chromogenic.

10. Metode Gel-Clot masih memiliki peran penting

Meningkatnya minat terhadap metode rekombinan dan metode kuantitatif tidak berarti metode gel-clot harus diabaikan. Metode gel-clot masih menjadi pendekatan yang sederhana untuk mendeteksi endotoksin dan sangat berguna ketika pengujian batas (limit test) sesuai dengan tujuan pemeriksaan. Keunggulannya antara lain:

• Hasil mudah diamati secara visual
• Kebutuhan instrumen relatif terbatas
• Prosedur pengujian sederhana
• Dapat digunakan untuk pengujian batas yang sesuai
• Sudah dikenal luas oleh banyak laboratorium QC

FireGene menyediakan Gel-Clot Endotoxin Test Kit bagi laboratorium yang menggunakan metode ini. Pemilihan metode tetap harus disesuaikan dengan tujuan pengujian. Laboratorium yang melakukan pemeriksaan rutin untuk memastikan sampel memenuhi batas endotoksin mungkin memiliki kebutuhan yang berbeda dengan laboratorium berkapasitas tinggi yang memerlukan data kuantitatif untuk analisis tren.

11. Kurva standar tetap menjadi dasar pengujian kuantitatif

Dalam metode pengujian endotoksin kuantitatif, kurva standar merupakan salah satu control analisis yang sangat penting. Kurva tersebut menunjukkan hubungan antara respons yang diukur dan konsentrasi endotoksin. Laboratorium perlu mengevaluasi:

• Rentang kurva
• Kesesuaian model kurva (curve fit)
• Konsistensi hasil pengulangan
• Kinerja kontrol
• Hasil yang menyimpang (outlier)
• Posisi sampel pada plate
• Kesesuaian pengenceran sampel

Kurva yang terlihat bagus belum tentu berarti seluruh rangkaian pengujian valid. Kurva standar harus dinilai bersama kontrol lain yang dipersyaratkan. Hal ini penting terutama pada sistem pembacaan plate otomatis. Banyaknya data yang dihasilkan tidak otomatis menjamin bahwa hasil analisis benar. Data yang lebih banyak tidak selalu berarti data yang lebih baik.

12. Kualitas peralatan laboratorium dan air tetap penting

Mengganti reagen endotoksin tidak menghilangkan risiko kontaminasi dari lingkungan laboratorium. Endotoksin dapat masuk melalui berbagai sumber, seperti:

• Air
• Wadah sampel
• Tip pipet
• Tabung
• Vial
• Permukaan yang bersentuhan dengan sampel
• Proses persiapan reagen
• Penanganan sampel yang tidak tepat

Karena itu, laboratorium perlu mengendalikan seluruh sistem pengujian, termasuk peralatan, bahan habis pakai, dan air yang digunakan. FireGene menyediakan Pyrogen-Free Vials untuk membantu mengendalikan penanganan sampel. Produk Endotoxin Assay Water dapat digunakan ketika air dengan pengendalian endotoksin diperlukan untuk persiapan atau pengenceran sampel.

Prinsipnya sederhana: Metode yang sensitif tidak dapat mengatasi masalah kontaminasi akibat penanganan yang buruk.

13. Apa yang perlu dipertimbangkan sebelum mengganti metode?

Laboratorium yang ingin beralih dari satu metode pengujian endotoksin ke metode lain sebaiknya tidak menganggap perubahan tersebut hanya sebagai penggantian reagen.

Ada beberapa aspek yang perlu dievaluasi.

Evaluasi ini membantu menghindari kesalahan yang sering terjadi: memilih metode terlebih dahulu, kemudian baru menemukan keterbatasannya setelah metode diterapkan.

14. Transfer metode semakin penting ketika laboratorium menggunakan sistem yang seragam

Perusahaan farmasi yang memiliki beberapa laboratorium dapat mengembangkan metode pengujian di satu lokasi dan menerapkannya di lokasi lain. Ketika platform pengujian endotoksin baru diperkenalkan, transfer metode perlu mendapat perhatian khusus. Beberapa faktor yang perlu dikendalikan meliputi:

• Pengelolaan lot reagen
• Persiapan standar
• Konfigurasi peralatan
• Kondisi inkubasi
• Pengaturan software
• Tata letak sampel pada plate
• Teknik analis
• Persiapan sampel
• Kinerja PPC
• Kinerja kurva standar
• Kriteria penerimaan hasil

Metode yang memberikan hasil baik di Laboratorium A tidak boleh langsung diasumsikan memberikan hasil yang sama di Laboratorium B. Hal ini terutama berlaku jika kedua laboratorium menggunakan instrumen, bahan habis pakai, analis, atau prosedur penanganan sampel yang berbeda.

15. Bagaimana perkembangan regulasi pada tahun 2026 memengaruhi pemilihan metode?

Regulasi pengujian endotoksin semakin memberikan pilihan metode, tetapi fleksibilitas ini tidak berarti tanggung jawab laboratorium menjadi lebih ringan. Revisi panduan FDA pada Maret 2026 memperluas cakupan pembahasan untuk mengakomodasi reagen rekombinan. FDA juga menekankan perlunya memastikan kesesuaian metode dengan tujuan penggunaannya.

Pesan penting bagi laboratorium QC adalah: Semakin banyak pilihan metode, semakin penting pula proses pemilihan dan verifikasi metode.

Pertanyaan yang perlu diajukan bukan hanya, “Metode pengujian endotoksin mana yang diperbolehkan?” Pertanyaan yang lebih tepat adalah:

“Metode mana yang sesuai untuk produk ini, dalam kondisi pengujian yang digunakan, dan bagaimana kita membuktikan bahwa metode tersebut bekerja secara andal?”

Pendekatan ini mendorong pemilihan metode berdasarkan bukti ilmiah, bukan sekadar mengikuti tren teknologi.

16. Seperti apa masa depan pengujian endotoksin?

Ke depannya, kemungkinan tidak ada satu teknologi yang menggantikan seluruh metode pengujian endotoksin. Laboratorium justru dapat menggunakan beberapa metode sesuai kebutuhan, seperti:

• Gel-clot
• Kinetic chromogenic
• Metode fotometrik lainnya
• Recombinant Factor C
• Recombinant cascade reagent
• Platform berbeda untuk jenis produk yang berbeda

Pendekatan ini memberikan fleksibilitas lebih besar, tetapi juga membutuhkan pengendalian analisis yang lebih kuat. Laboratorium perlu memastikan adanya hubungan yang jelas antara:

Metode → Produk → Matriks → Spesifikasi → Kontrol → Kriteria penerimaan → Interpretasi data

Semakin beragam jenis produk dan metode yang digunakan, semakin penting pengendalian tersebut.

17. Pengujian endotoksin perlu dipandang sebagai bagian dari pengendalian sepanjang siklus produk

Pengujian endotoksin bukan sekadar kegiatan laboratorium yang berdiri sendiri. Strategi pengendalian yang menyeluruh dapat mencakup tahapan berikut:

1. Pengendalian bahan baku
2. Pengendalian air dan peralatan
3. Pengendalian proses produksi
4. Strategi pengambilan sampel
5. Penyimpanan dan penanganan sampel
6. Evaluasi kesesuaian metode
7. Pengujian endotoksin
8. Peninjauan data
9. Analisis tren hasil
10. Investigasi OOS dan penyimpangan

Pendekatan ini bermanfaat ketika terjadi perubahan produk, formulasi, peralatan, atau metode analisis. Sebagai contoh:

• Formulasi baru mungkin membutuhkan evaluasi interferensi ulang.
• Laboratorium baru mungkin membutuhkan transfer metode.
• Platform pengujian baru mungkin membutuhkan verifikasi.
• Lot reagen baru mungkin memerlukan kualifikasi yang sesuai.

Dengan demikian, strategi pengujian perlu disesuaikan dengan perkembangan proses produksi dan analisis.

Sumber : artikel FireGene, 30 September 2026 <https://firegene.com/blogs/knowledge-center/usp-86-and-the-future-of-endotoxin-testing-what-qc-laboratories-need-to-know-in-2026>